Javascript hazırda brauzerinizdə deaktiv edilib.Javascript deaktiv edildikdə, bu veb-saytın bəzi funksiyaları işləməyəcək.
Javier Fidalgo, * Pierre-Antoine Deglesne, * Rodrigo Arroyo, * Lilian Sepúlveda, * Evgeniya Ranneva, Philippe Deprez Elm Departamenti, Skin Tech Pharma Group, Castello D'Empúries, Kataloniya, İspaniya * Bu müəlliflərin bu iş haqqında bəzi fikirləri var Bərabər töhfə fonu: Hialuron turşusu (HA) estetik məqsədlər üçün dəri doldurucularının istehsalında istifadə edilən təbii polisaxariddir.İnsan toxumalarında bir neçə gün yarım ömrü olduğundan, HA əsaslı dermal doldurucular bədəndəki ömrünü uzatmaq üçün kimyəvi olaraq dəyişdirilir.Ticarət HA əsaslı doldurucularda ən çox yayılmış modifikasiya HA zəncirlərini çarpaz bağlamaq üçün 1,4-butandiol diglisidil efirinin (BDDE) istifadə edilməsidir.Qalıq və ya reaksiya verməmiş BDDE milyonda 2 hissədən (ppm) az olduqda qeyri-toksik hesab olunur;buna görə də, xəstənin təhlükəsizliyini təmin etmək üçün son dermal doldurucuda olan qalıq BDDE kəmiyyətcə qiymətləndirilməlidir.Materiallar və üsullar: Bu tədqiqat maye xromatoqrafiya və kütlə spektrometriyasını (LC-MS) birləşdirərək qələvi şəraitdə BDDE və HA arasında çarpaz əlaqə reaksiyasının əlavə məhsulunun aşkar edilməsini və xarakteristikasını təsvir edir.Nəticələr: Müxtəlif analizlərdən sonra məlum oldu ki, HA-BDDE hidrogelini dezinfeksiya etmək üçün istifadə edilən qələvi şərait və yüksək temperatur bu yeni əlavə məhsulun, “propilen qlikola bənzər” birləşmənin əmələ gəlməsinə kömək edib.LC-MS təhlili əlavə məhsulun BDDE ilə eyni monoizotop kütləyə, fərqli saxlama müddətinə (tR) və fərqli UV absorbsiyasına (λ=200 nm) malik olduğunu təsdiqlədi.BDDE-dən fərqli olaraq, LC-MS analizində müşahidə edilmişdir ki, eyni ölçmə şəraitində bu əlavə məhsul 200 nm-də daha yüksək aşkarlama sürətinə malikdir.Nəticə: Bu nəticələr göstərir ki, bu yeni birləşmənin strukturunda epoksid yoxdur.Müzakirə kommersiya məqsədləri üçün HA-BDDE hidrogel (HA dermal doldurucu) istehsalında tapılan bu yeni əlavə məhsulun riskini qiymətləndirmək üçün açıqdır.Açar sözlər: hialuron turşusu, HA dermal doldurucu, çarpaz bağlı hialuron turşusu, BDDE, LC-MS analizi, BDDE əlavə məhsulu.
Hialuron turşusuna (HA) əsaslanan doldurucular kosmetik məqsədlər üçün istifadə edilən ən çox yayılmış və populyar dermal dolduruculardır.1 Bu dermal doldurucu adətən >95% su və 0,5-3% HA-dan ibarət olan hidrogeldir ki, bu da onlara gel kimi bir quruluş verir.2 HA bir polisaxariddir və onurğalıların hüceyrədənkənar matrisinin əsas komponentidir.Tərkiblərdən biri.O, (1,4)-qlükuron turşusu-β (1,3)-N-asetilqlükozamin (GlcNAc) təkrarlanan qlikozid bağları ilə bağlanmış disakarid birləşmələrindən ibarətdir.Bu disaxarid nümunəsi bütün orqanizmlərdə eynidir.Bəzi zülal əsaslı doldurucularla (məsələn, kollagen) müqayisədə bu xüsusiyyət HA-nı yüksək biouyğun molekula çevirir.Bu doldurucular xəstənin immun sistemi tərəfindən tanınan amin turşusu ardıcıllığının spesifikliyini nümayiş etdirə bilər.
Dəri doldurucu kimi istifadə edildikdə, HA-nın əsas məhdudiyyəti hialuronidaza adlanan xüsusi bir ferment ailəsinin olması səbəbindən toxumalarda sürətli dövriyyəsidir.İndiyədək toxumalarda HA-nın yarı ömrünü artırmaq üçün HA strukturunda bir neçə kimyəvi modifikasiya təsvir edilmişdir.3 Bu modifikasiyaların əksəriyyəti HA zəncirlərini çarpaz bağlamaqla hialuronidazın polisaxarid polimerlərə çıxışını azaltmağa çalışır.Buna görə də, HA strukturu ilə çarpaz bağlayan agent arasında körpülərin və molekullararası kovalent bağların əmələ gəlməsi səbəbindən, çarpaz bağlı HA hidrogel təbii HA-dan daha çox anti-ferment deqradasiya məhsulları istehsal edir.4-6
İndiyə qədər çapraz bağlı HA istehsal etmək üçün istifadə edilən kimyəvi çarpaz bağlama agentlərinə metakrilamid, 7 hidrazid, 8 karbodiimid, 9 divinil sulfon, 1,4-butandiol diglisidil efir (BDDE) və poli(etilen qlikol) diglisidil efir daxildir.10 ,11 BDDE hal-hazırda ən çox istifadə edilən crosslinking agentidir.Bu tip hidrogellərin onilliklər ərzində təhlükəsiz olduğu sübuta yetirilsə də, istifadə olunan çarpaz əlaqə agentləri sitotoksik və bəzi hallarda mutagen ola bilən reaktiv reagentlərdir.12 Buna görə də son hidrogeldə onların qalıq tərkibi yüksək olmalıdır.Qalıq konsentrasiya milyonda 2 hissədən (ppm) az olduqda BDDE təhlükəsiz sayılır.4
Aşağı qalıqlı BDDE konsentrasiyasını, HA hidrojellərində çarpaz əlaqə dərəcəsini və əvəzetmə mövqeyini aşkar etmək üçün qaz xromatoqrafiyası, kütlə spektrometriyası (MS) ilə birləşdirilmiş ölçü istisna xromatoqrafiyası, nüvə maqnit rezonansı (NMR) flüoresans ölçmə üsulları və kimi bir neçə üsul mövcuddur. Diod massivi birləşdirilmiş yüksək performanslı maye xromatoqrafiyası (HPLC).13-17 Bu tədqiqat qələvi şəraitdə BDDE və HA-nın reaksiyası nəticəsində əldə edilən son çarpaz bağlı HA hidrogeldə əlavə məhsulun aşkar edilməsini və xarakteristikasını təsvir edir.HPLC və maye xromatoqrafiya-kütləvi spektrometriya (LC-MS analizi).BDDE-nin bu əlavə məhsulunun toksikliyi naməlum olduğundan, biz onun qalıqlarının kəmiyyətinin son məhsulda adətən BDDE-də həyata keçirilən metoda oxşar şəkildə təyin edilməsini tövsiyə edirik.
HA-nın əldə edilmiş natrium duzunun (Shiseido Co., Ltd., Tokio, Yaponiya) molekulyar çəkisi ~1,368,000 Da (Laurent üsulu) 18 və daxili özlülüyü 2,20 m3/kq təşkil edir.Çarpaz əlaqə reaksiyası üçün BDDE (≥95%) Sigma-Aldrich Co.-dan (Sent-Luis, MO, ABŞ) alınmışdır.Sigma-Aldrich şirkətindən pH 7.4 olan fosfat tamponlu şoran alınıb.LC-MS analizində istifadə olunan bütün həlledicilər, asetonitril və su HPLC dərəcəli keyfiyyətdən alınmışdır.Qarışqa turşusu (98%) reagent növü kimi alınır.
Bütün təcrübələr UPLC Acquity sistemində (Waters, Milford, MA, ABŞ) həyata keçirilib və elektrosprey ionlaşma mənbəyi ilə təchiz edilmiş API 3000 üçlü dördqütblü kütlə spektrometrinə qoşulub (AB SCIEX, Framingham, MA, ABŞ).
Çapraz bağlı HA hidrogellərinin sintezi 1% qələvi (natrium hidroksid, NaOH) varlığında 10% (ağırlıq/ağırlıq) natrium hialuronat (NaHA) məhluluna 198 mq BDDE əlavə etməklə başlanmışdır.Reaksiya qarışığında son BDDE konsentrasiyası 9,9 mq/mL (0,049 mM) olmuşdur.Sonra, reaksiya qarışığı yaxşıca qarışdırıldı və homojenləşdirildi və 45 ° C-də 4 saat davam etməyə icazə verildi.19 Reaksiya pH-ı ~12 səviyyəsində saxlanılır.
Bundan sonra reaksiya qarışığı su ilə yuyuldu və son HA-BDDE hidrogeli süzüldü və 10-25 mq/ml HA konsentrasiyası və 7.4 yekun pH əldə etmək üçün PBS tamponu ilə seyreltildi.İstehsal edilmiş çapraz bağlı HA hidrogelləri sterilizasiya etmək üçün bütün bu hidrogellər avtoklavlanır (120°C-də 20 dəqiqə).Təmizlənmiş BDDE-HA hidrogel analiz edilənə qədər 4°C-də saxlanılır.
Çarpaz bağlı HA məhsulunda mövcud olan BDDE-ni təhlil etmək üçün 240 mq nümunə çəkildi və mərkəzi dəliyə daxil edildi (Microcon®; Merck Millipore, Billerica, MA, ABŞ; həcm 0,5 mL) və otaq temperaturunda 10,000 rpm-də sentrifuqa edildi. 10 dəqiqə.Cəmi 20 µL aşağı açılan maye toplandı və təhlil edildi.
BDDE standartını (Sigma-Aldrich Co) qələvi şəraitdə (1%, 0.1% və 0.01% NaOH) təhlil etmək üçün aşağıdakı şərtlər yerinə yetirilirsə, maye nümunəsi 1:10, 1:100 və ya qədərdir. 1:1,000,000 Lazım gələrsə, analiz üçün MilliQ deionlaşdırılmış sudan istifadə edin.
Çarpaz birləşmə reaksiyasında istifadə edilən başlanğıc materiallar üçün (HA 2%, H2O, 1% NaOH və 0,049 mM BDDE) bu materiallardan hazırlanmış hər nümunədən 1 mL eyni analiz şərtlərindən istifadə etməklə təhlil edilmişdir.
İon xəritəsində görünən zirvələrin spesifikliyini müəyyən etmək üçün 20 µL nümunəyə 10 µL 100 ppb BDDE standart məhlulu (Sigma-Aldrich Co) əlavə edildi.Bu halda, hər bir nümunədə standartın son konsentrasiyası 37 ppb-dir.
Əvvəlcə 10 μL standart BDDE (Sigma-Aldrich Co) 990 μL MilliQ su (sıxlıq 1,1 q/mL) ilə seyreltməklə 11,000 mq/L (11,000 ppm) konsentrasiyası olan BDDE ehtiyat məhlulu hazırlayın.Aralıq standart seyreltmə kimi 110 µg/L (110 ppb) BDDE məhlulu hazırlamaq üçün bu məhluldan istifadə edin.Sonra, 75, 50, 25, 10 və 1 ppb istənilən konsentrasiyaya nail olmaq üçün ara qatılaşdırıcını bir neçə dəfə seyreltməklə standart əyrini hazırlamaq üçün aralıq BDDE standart seyrelticisini (110 ppb) istifadə edin.Şəkil 1-də göstərildiyi kimi, 1.1-dən 110 ppb-ə qədər olan BDDE standart əyrisinin yaxşı xəttiliyə malik olduğu aşkar edilmişdir (R2>0.99).Standart əyri dörd müstəqil təcrübədə təkrarlandı.
Şəkil 1 BDDE standart kalibrləmə əyrisi LC-MS analizi ilə əldə edilmiş və yaxşı korrelyasiya müşahidə olunur (R2>0.99).
İxtisarlar: BDDE, 1,4-butandiol diglisidil efiri;LC-MS, maye xromatoqrafiyası və kütlə spektrometriyası.
Çapraz bağlı HA-da mövcud olan BDDE standartlarını və əsas məhluldakı BDDE standartlarını müəyyən etmək və kəmiyyətini müəyyən etmək üçün LC-MS analizindən istifadə edilmişdir.
Xromatoqrafik ayrılma LUNA 2,5 µm C18(2)-HST sütununda (50×2,0 mm2; Phenomenex, Torrance, CA, ABŞ) əldə edildi və analiz zamanı otaq temperaturunda (25°C) saxlanıldı.Mobil faza asetonitrildən (həlledici A) və tərkibində 0,1% qarışqa turşusu olan sudan (həlledici B) ibarətdir.Mobil faza qradiyent elüsyonu ilə təmizlənir.Qradiyent aşağıdakı kimidir: 0 dəqiqə, 2% A;1 dəqiqə, 2% A;6 dəqiqə, 98% A;7 dəqiqə, 98% A;7,1 dəqiqə, 2% A;10 dəqiqə, 2% A. İşləmə müddəti 10 dəqiqə və enjeksiyonun həcmi 20 µL-dir.BDDE-nin saxlanma müddəti təxminən 3,48 dəqiqədir (təcrübələrə əsasən 3,43 ilə 4,14 dəqiqə arasında dəyişir).Mobil faza LC-MS analizi üçün 0,25 mL/dəq axın sürətində vuruldu.
BDDE təhlili və MS tərəfindən kəmiyyətin müəyyən edilməsi üçün UPLC sistemi (Sular) elektrosprey ionlaşma mənbəyi ilə təchiz edilmiş API 3000 üçlü dördqütblü kütlə spektrometri (AB SCIEX) ilə birləşdirilir və təhlil müsbət ion rejimində (ESI+) aparılır.
BDDE-də aparılan ion fraqment analizinə əsasən, ən yüksək intensivliyə malik fraqmentin 129.1 Da-ya uyğun fraqment olduğu müəyyən edilmişdir (Şəkil 6).Buna görə də, kəmiyyətin müəyyən edilməsi üçün çox ionlu monitorinq rejimində (MIM) BDDE-nin kütləyə çevrilməsi (kütlənin yüklənmə nisbəti [m/z]) 203,3/129,1 Da təşkil edir.O, həmçinin LC-MS təhlili üçün tam skan (FS) rejimi və məhsulun ion skanı (PIS) rejimindən istifadə edir.
Metodun spesifikliyini yoxlamaq üçün boş nümunə (ilkin mobil mərhələ) təhlil edilmişdir.Kütləvi çevrilmə 203.3/129.1 Da olan boş nümunədə heç bir siqnal aşkar edilmədi.Təcrübənin təkrarlanabilirliyinə gəldikdə, 55 ppb (kalibrləmə əyrisinin ortasında) 10 standart inyeksiya təhlil edildi, nəticədə qalıq standart sapma (RSD) <5% (məlumatlar göstərilmir).
Qalıq BDDE tərkibi dörd müstəqil eksperimentə uyğun gələn səkkiz müxtəlif avtoklavlanmış BDDE çarpaz bağlı HA hidrogelində ölçüldü.“Materiallar və Metodlar” bölməsində təsvir olunduğu kimi, kəmiyyət 203.3/129.1 Da BDDE kütlə keçidində müəyyən edilmiş unikal zirvəyə uyğun gələn BDDE standart qatılmasının reqressiya əyrisinin orta dəyəri ilə qiymətləndirilir. 3.43-dən 4.14 dəqiqəyə qədər vaxt Gözləmirik.Şəkil 2 10 ppb BDDE istinad standartının nümunə xromatoqramını göstərir.Cədvəl 1 səkkiz müxtəlif hidrogelin qalıq BDDE tərkibini ümumiləşdirir.Qiymət diapazonu 1 ilə 2,46 ppb arasındadır.Buna görə də, nümunədəki qalıq BDDE konsentrasiyası insan istifadəsi üçün məqbuldur (<2 ppm).
Şəkil 2 10 ppb BDDE istinad standartının (Sigma-Aldrich Co) ion xromatoqramı, 203.30/129.10 Da (müsbət MRM rejimində) LC-MS analizi ilə əldə edilmiş MS (m/z) keçidi.
İxtisarlar: BDDE, 1,4-butandiol diglisidil efiri;LC-MS, maye xromatoqrafiya və kütləvi spektrometriya;MRM, çoxsaylı reaksiya monitorinqi;MS, kütlə;m/z, kütlə-yük nisbəti.
Qeyd: 1-8 nümunələri avtoklavlanmış BDDE çarpaz bağlı HA hidrogelləridir.Hidrojeldə BDDE-nin qalıq miqdarı və BDDE saxlama müddətinin pik həddi də bildirilir.Nəhayət, müxtəlif saxlama müddətlərinə malik yeni zirvələrin mövcudluğu da bildirilir.
İxtisarlar: BDDE, 1,4-butandiol diglisidil efiri;HA, hialuron turşusu;MRM, çoxsaylı reaksiya monitorinqi;tR, saxlama müddəti;LC-MS, maye xromatoqrafiya və kütləvi spektrometriya;RRT, nisbi saxlama müddəti.
Təəccüblüdür ki, LC-MS ion xromatoqramının təhlili göstərdi ki, təhlil edilən bütün avtoklavlanmış çarpaz bağlı HA hidrogel nümunələri əsasında 2,73 ilə 3,29 dəqiqə arasında daha qısa saxlama müddətində əlavə pik var.Məsələn, Şəkil 3 çarpaz bağlı HA nümunəsinin ion xromatoqramını göstərir, burada əlavə pik təqribən 2,71 dəqiqəlik fərqli saxlama müddətində görünür.Yeni müşahidə olunan pik ilə BDDE-dən pik arasında müşahidə edilən nisbi saxlama müddəti (RRT) 0,79 (Cədvəl 1) olduğu aşkar edilmişdir.LC-MS analizində istifadə edilən C18 sütununda yeni müşahidə edilən zirvənin daha az saxlanıldığını bildiyimiz üçün yeni pik BDDE-dən daha qütblü birləşməyə uyğun ola bilər.
Şəkil 3 LC-MS (MRM kütləsinin çevrilməsi 203.3/129.0 Da) ilə əldə edilmiş çarpaz bağlı HA hidrogel nümunəsinin ion xromatoqramı.
İxtisarlar: HA, hialuron turşusu;LC-MS, maye xromatoqrafiya və kütləvi spektrometriya;MRM, çoxsaylı reaksiya monitorinqi;RRT, nisbi saxlama müddəti;tR, saxlama müddəti.
Müşahidə olunan yeni zirvələrin ilkin olaraq istifadə olunan xammalda mövcud olan çirkləndiricilər ola biləcəyi ehtimalını istisna etmək üçün bu xammallar da eyni LC-MS analiz metodundan istifadə etməklə təhlil edilmişdir.Təhlil edilən başlanğıc materiallara su, suda 2% NaHA, suda 1% NaOH və çarpaz birləşmə reaksiyasında istifadə edilən eyni konsentrasiyada BDDE daxildir.İstifadə olunan başlanğıc materialın ion xromatoqramı heç bir birləşmə və ya pik göstərməmişdir və onun saxlanma müddəti müşahidə edilən yeni pikə uyğundur.Bu fakt təkcə başlanğıc materialın tərkibində analiz proseduruna mane ola biləcək hər hansı birləşmə və ya maddələr ola biləcəyi fikrini rədd edir, lakin digər laboratoriya məhsulları ilə mümkün çarpaz çirklənmə əlaməti yoxdur.BDDE və yeni piklərin LC-MS analizindən sonra əldə edilən konsentrasiya dəyərləri Cədvəl 2 (nümunələr 1-4) və Şəkil 4-də ion xromatoqramı göstərilmişdir.
Qeyd: Nümunələr 1-4 avtoklavlanmış BDDE çarpaz bağlı HA hidrogellərinin istehsalı üçün istifadə olunan xammala uyğun gəlir.Bu nümunələr avtoklavlanmamışdır.
İxtisarlar: BDDE, 1,4-butandiol diglisidil efiri;HA, hialuron turşusu;LC-MS, maye xromatoqrafiya və kütləvi spektrometriya;MRM, çoxlu reaksiya monitorinqi.
Şəkil 4 HA və BDDE-nin çarpaz əlaqə reaksiyasında istifadə olunan xammal nümunəsinin LC-MS xromatoqramına uyğundur.
Qeyd: Bütün bunlar çarpaz birləşmə reaksiyasını həyata keçirmək üçün istifadə edilən eyni konsentrasiyada və nisbətdə ölçülür.Xromatoqramma ilə təhlil edilən xammal üçün rəqəmlər uyğun gəlir: (1) su, (2) 2% HA sulu məhlulu, (3) 1% NaOH sulu məhlulu.LC-MS analizi 203.30/129.10 Da (müsbət MRM rejimində) kütləvi çevrilmə üçün aparılır.
İxtisarlar: BDDE, 1,4-butandiol diglisidil efiri;HA, hialuron turşusu;LC-MS, maye xromatoqrafiya və kütləvi spektrometriya;MRM, çoxlu reaksiya monitorinqi.
Yeni zirvələrin yaranmasına səbəb olan şərait öyrənilib.Çarpaz bağlı HA hidrogelinin istehsalı üçün istifadə olunan reaksiya şəraitinin BDDE çarpaz birləşdirici agentin reaktivliyinə necə təsir etdiyini və yeni piklərin (mümkün əlavə məhsullar) əmələ gəlməsinə səbəb olduğunu öyrənmək üçün müxtəlif ölçmələr aparılmışdır.Bu təyinatlarda biz sulu mühitdə müxtəlif konsentrasiyalarda NaOH (0%, 1%, 0.1% və 0.01%) ilə işlənmiş, ardınca avtoklavlama və ya etmədən son BDDE çarpaz bağlayıcısını öyrəndik və təhlil etdik.Eyni şərtləri simulyasiya etmək üçün bakteriya proseduru, çarpaz bağlı HA hidrogel istehsal etmək üçün istifadə edilən üsulla eynidir.“Materiallar və Metodlar” bölməsində təsvir olunduğu kimi, nümunənin kütləvi keçidi LC-MS ilə 203.30/129.10 Da-a təhlil edilmişdir.BDDE və yeni zirvənin konsentrasiyası hesablanır və nəticələr Cədvəl 3-də göstərilir. Məhlulda NaOH varlığından asılı olmayaraq avtoklavlanmamış nümunələrdə yeni piklər aşkar edilməmişdir (nümunələr 1-4, Cədvəl 3).Avtoklavlanmış nümunələr üçün yeni piklər yalnız məhlulda NaOH olduqda aşkar edilir və pikin əmələ gəlməsi məhluldakı NaOH konsentrasiyasından (nümunələr 5-8, Cədvəl 3) asılıdır (RRT = 0,79).Şəkil 5-də NAOH varlığında və ya olmamasında iki avtoklavlanmış nümunəni göstərən ion xromatoqramı nümunəsi göstərilir.
İxtisarlar: BDDE, 1,4-butandiol diglisidil efiri;LC-MS, maye xromatoqrafiya və kütləvi spektrometriya;MRM, çoxlu reaksiya monitorinqi.
Qeyd: Üst xromatoqram: Nümunə 0,1% NaOH sulu məhlulu ilə işlənmiş və avtoklavlanmışdır (20 dəqiqə ərzində 120°C).Aşağı xromatoqram: Nümunə NaOH ilə müalicə olunmayıb, eyni şəraitdə avtoklavda saxlanılıb.203.30/129.10 Da (müsbət MRM rejimində) kütlə çevrilməsi LC-MS tərəfindən təhlil edilmişdir.
İxtisarlar: BDDE, 1,4-butandiol diglisidil efiri;LC-MS, maye xromatoqrafiya və kütləvi spektrometriya;MRM, çoxlu reaksiya monitorinqi.
NaOH olan və ya olmayan bütün avtoklav nümunələrində BDDE konsentrasiyası xeyli azalmışdır (16,6 dəfəyə qədər) (nümunələr 5-8, Cədvəl 2).BDDE konsentrasiyasının azalması yüksək temperaturda suyun BDDE-nin epoksid halqasını açmaq üçün 1,2-diol birləşməsini yaratmaq üçün əsas (nukleofil) kimi çıxış edə bilməsi ilə əlaqədar ola bilər.Bu birləşmənin monoizotop keyfiyyəti BDDE-dən fərqlidir və buna görə də təsirlənməyəcəkdir.LC-MS 203.30/129.10 Da kütləvi yerdəyişmə aşkar etdi.
Nəhayət, bu təcrübələr göstərir ki, yeni piklərin yaranması BDDE, NAOH və avtoklavlama prosesindən asılıdır, lakin HA ilə heç bir əlaqəsi yoxdur.
Təxminən 2,71 dəqiqə saxlama müddətində tapılan yeni zirvə daha sonra LC-MS ilə xarakterizə edildi.Bu məqsədlə BDDE (9,9 mq/mL) 1%-li NaOH sulu məhlulunda inkubasiya edilmiş və avtoklavlanmışdır.Cədvəl 4-də yeni zirvənin xüsusiyyətləri məlum BDDE istinad zirvəsi ilə müqayisə edilir (saxlanma müddəti təxminən 3,47 dəqiqə).İki zirvənin ion parçalanma təhlili əsasında belə nəticəyə gəlmək olar ki, saxlama müddəti 2,72 dəqiqə olan pik BDDE zirvəsi ilə eyni fraqmentləri göstərir, lakin müxtəlif intensivliyə malikdir (Şəkil 6).2,72 dəqiqəlik saxlama müddətinə (PIS) uyğun gələn pik üçün 147 Da kütləsində parçalanmadan sonra daha intensiv pik müşahidə edildi.Bu təyinatda istifadə edilən BDDE konsentrasiyasında (9,9 mq/mL) xromatoqrafik ayırmadan sonra ultrabənövşəyi spektrdə müxtəlif absorbsiya rejimləri (UV, λ=200 nm) də müşahidə edilmişdir (Şəkil 7).2,71 dəqiqə saxlama müddəti olan zirvə hələ də 200 nm-də görünür, eyni şəraitdə BDDE zirvəsi isə xromatoqramda müşahidə edilə bilməz.
Cədvəl 4 Təxminən 2,71 dəqiqə saxlama müddəti ilə yeni zirvənin və 3,47 dəqiqə saxlama müddəti ilə BDDE pikinin xarakteristikasının nəticələri
Qeyd: Bu nəticələri əldə etmək üçün iki zirvədə LC-MS və HPLC analizləri (MRM və PIS) aparılmışdır.HPLC analizi üçün 200 nm dalğa uzunluğu ilə UV aşkarlama istifadə olunur.
İxtisarlar: BDDE, 1,4-butandiol diglisidil efiri;HPLC, yüksək performanslı maye xromatoqrafiyası;LC-MS, maye xromatoqrafiya və kütləvi spektrometriya;MRM, çoxsaylı reaksiya monitorinqi;m/z, kütlənin yükə nisbəti;PIS, məhsul ionlarının skan edilməsi;ultrabənövşəyi işıq, ultrabənövşəyi işıq.
Qeyd: Kütləvi fraqmentlər LC-MS analizi (PIS) ilə əldə edilir.Üst xromatoqram: BDDE standart nümunə fraqmentlərinin kütləvi spektri.Aşağı xromatoqram: Aşkar edilmiş yeni zirvənin kütlə spektri (BDDE zirvəsi ilə əlaqəli RRT 0,79-dur).BDDE 1% NaOH məhlulunda işlənmiş və avtoklavlanmışdır.
İxtisarlar: BDDE, 1,4-butandiol diglisidil efiri;LC-MS, maye xromatoqrafiya və kütləvi spektrometriya;MRM, çoxsaylı reaksiya monitorinqi;PIS, məhsulun ion skanı;RRT, nisbi saxlama müddəti.
Şəkil 7 203.30 Da prekursor ionunun ion xromatoqramı və (A) saxlama müddəti 2.71 dəqiqə olan yeni pik və (B) 200 nm-də 3.46 dəqiqədə BDDE istinad standart pikinin UV aşkarlanması.
İstehsal edilən bütün çarpaz bağlı HA hidrogellərində LC-MS kəmiyyətinin müəyyən edilməsindən sonra qalıq BDDE konsentrasiyasının <2 ppm olduğu, lakin analizdə yeni naməlum pik meydana gəldiyi müşahidə edildi.Bu yeni zirvə BDDE standart məhsuluna uyğun gəlmir.BDDE standart məhsulu da müsbət MRM rejimində eyni keyfiyyətə çevrilmə (MRM çevrilməsi 203.30/129.10 Da) təhlilindən keçib.Ümumiyyətlə, xromatoqrafiya kimi digər analitik üsullar hidrogellərdə BDDE-ni aşkar etmək üçün limit testləri kimi istifadə olunur, lakin maksimum aşkarlama həddi (LOD) 2 ppm-dən bir qədər aşağıdır.Digər tərəfdən, indiyə qədər NMR və MS, çarpaz bağlı HA məhsullarının şəkər vahidi fraqmentlərində HA-nın çarpaz əlaqə və / və ya modifikasiya dərəcəsini xarakterizə etmək üçün istifadə edilmişdir.Bu üsulların məqsədi heç vaxt bu məqalədə təsvir etdiyimiz kimi (LC-MS metodumuzun LOD = 10 ppb) aşağı konsentrasiyalarda qalıq BDDE aşkarlanmasının kəmiyyətini müəyyən etmək olmamışdır.
Göndərmə vaxtı: 01 sentyabr 2021-ci il